labflytrap * masožravé rostliny * in vitro * mikropropagace * fotogalerie * masožravky * labflytrap
English version
labflytrap
English version

MIMOŘÁDNÁ NABÍDKA - IN VITRO - LABFLYTRAP - KONTAKT- ODKAZY

 
 

Rozmnožování masožravých rostlin

v in vitro kulturách.

Průběžně aktualizovaná fotogalerie in vitro kultur masožravých rostlin

Krása TC

Samostatnou kapitolou rozmnožování masožravých rostlin je kultivace rostlin ve sterilním prostředí, na živných agarových médiích.  Explantátové kultury, kultury in vitro, mikropropagace rostlin, tkáňové kultury, plant tissue culture – pod těmito výrazy můžeme tyto techniky vyhledávat. Podstatou těchto technologií je převedení rostlinného materiálu do sterilního prostředí, bez přítomnosti jiných organismů.  Tento převod do sterilního prostředí je podstatný pro nerušený buněčný proces a při ovlivnění hormony se využije genetické dispozice dané rostliny k její rozsáhlé reprodukci. Prorůstání nových rostlinek probíhá v takové míře, ve které by to v přirozených podmínkách nebylo možné. Takto můžeme na ploše jednoho čtverečního metru získat v průběhu jednoho roku kolem 70 000 rostlinek Mucholapky podivné, až 100 000 ks běžných rosnatek atd. V tomto tedy spočívají nesporně obrovské přednosti těchto technologií. V relativně krátké době je možné rozmnožit velmi vzácné, nebo v přírodě kriticky ohrožené druhy rostlin a dostat je tak do kolekcí sběratelů, bez narušení jejich přirozených biotopů ať změnami vyvolanými lidskou činností nebo změnami klimatu, a to pouze odebráním jednoho úžlabního pupenu z matečné rostliny nebo pomocí pár semen pro získání sterilní kultury.
V celém procesu kultivace je nezbytné se zabývat sterilitou použitého rostlinného materiálu, sterilitou prostředí, ve kterém s explantáty pracujeme a sterilitou živných médií. Kultivace v aseptickém prostředí má své nevýhody /drahé přístroje, chemikálie, pracnost a nepohodlí v boxu/, ale je nezbytná vzhledem k tomu, že v médiu je obsažen především cukr a vitamíny. A v takovémto prostředí rostou bakterie a houby řádově  rychleji než samotné explantáty a během velmi krátké doby jsou schopny zničit celou kulturu. Prvním a nejdůležitějším krokem bude získat prvotní sterilní kulturu. Část rostliny zbavenou všech cizorodých organismů.

dafadsf


            Příprava pasáže - nádoby s médiem prošly autoklávem

Proces mikropropagace lze rozdělit do několika fází. První bude výběr typu explantátu, tedy části matečné rostliny, kterou budeme hodnotit i z hlediska jejího zdravotního stavu a kondice. Podle druhu zvolíme princip rozmnožování a po té odebereme příslušný segment. Celý list, prýt, okvětní lístky, z růstového vrcholku je možné odebrat jeho aktivní část, které se říká meristém. Jedná se o shluk buněk o velikosti zhruba 0,2 mm, které nemají vazbu na  cévní svazky, které představují hlavní cesty šíření patogenů. Tato technika má velký význam při ozdravování rostlin od viróz, bakteriálních a houbových nákaz. Z naklíčených semen to může být část hypokotylu - prvního podděložního článku, nebo izolací embrya bez endospermu , který může jeho vývoj brzdit.

Druhou fází bude odvození sterilní kultury. Dokonalá desinfekce explantátu je prvním krokem k úspěchu. Zde se používá celá řada preparátů počínaje antibiotiky, etanolem, komerčními bělícími prostředky. Tyto se navzájem kombinují a podle potřeby i opakují.

T řetí fází je množení. Zde, za pomoci kombinace hormonů z oblasti cytokininů a auxinů, dochází ve velké míře k prorůstání nových prýtů. Tyto se dále dělí – pasážují do dalších nádob na čerstvé médium až do požadovaného množství. Množitelské koeficienty jsou u různých rostlin rozdílné. Každý druh může mít jiné požadavky na složení základního média – koncentraci mikro a makro elementů, vitamínů, druhů hormonů a jejich  kombinací.

Sestavení základního média.


Živné médium je zpravidla složeno z  mikro elementů, makro elementů, vitamínů, hormonů, cukru a gelující látky. Nastavení pH roztoku podle požadavku – obvykle 5,5-5,8 Nejběžněji používaným médiem je MURASHIGE & SKOOG, které bylo vyvinuto pro kulturu tabáku v 60 letech minulého století a v různých modifikacích se používá do dnes. Od té doby byla vyvinuta celá řada dalších specializovaných na určité druhy rostlin a ve vývoji se pokračuje dále.

Porovnání hodnot koncentrací mikro a makro elementů vybraných médií

M&S medium mg/1
Knudson C orchid medium/Morel modifikation/ mg/1
Anderson´s
Rhododendron
medium mg/1
Schenk&Hildebrandt
medium mg/1
Mikro elementy
CoC12.6H20
0.025
0,025
0,1
FeSo4.7H2O
25,00
CuS04.5H20
0.025
0,025
0,2
FeNaEDTA
36.70
73,40
19,8
H3B03
6.20
6,2
5,0
KI
0.83
0,3
1,0
MnSO4.H20
16.90
5,68
16,90
10,0
Na2MoO4.2H20
0.25
0,25
0,1
ZnS04.7H20
8.60
8,60
1,0
 
 
 
 
Makro elementy
CaCI2
332.02 
332,02
151,0
Ca(NO3)2
241,30
KCI
250,00
KH2PO4
170.00
250,00
KN03
1900.00
480,00
2500,0
MgSO4
180.54
122,15
180,54
195,05
NH4N03
1650.00
500,00
400,00
(NH4) H2PO4
300,0
(NH4)2SO4
500,00
NaH2PO4
330,60
celkem
4302,09
1894,13
1828,86
3183,25

Z vitamínů přidávaných do médií je nepostradatelný thiamin, užívá se v různých  koncentracích od M&S medium 0,1 mg/l, Nitsch medium 0,5 mg/l, Schenk&Hildebrandt  5mg/l, až Gamborg B5  10 mg/l. Ostatní používané vitamíny myo-inositol, k.nikotinová, piridoxin atd. jsou podpůrné pro stimulaci růstu, ale je možné se bez nich v řadě případů i obejít.
Dalším důležitým prvkem při sestavení média jsou rostlinné hormony. Rozeznáváme pět základních skupin:  auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová a etylén. Zajímat nás budou zejména uvedené první tři.

Z auxinů můženme jmenovat:

kyselina indolyl-3-octová                  IAA
kyselina indolyl-3-máselná               IBA
a-naftyloctová                                 NAA

2,4-dichlorfenoxyoctová              2,4-D,
deriváty kyseliny pikolinové         picloram
benzoové kyseliny                      dicamba
kyselina indolyl-3-propionová      IPA

Auxiny podporují prodlužování buněk, způsobují apikální dominanci, stimulují vývoj cévních svazků a  růst kořene, podporují i zakládání adventivních kořenů.

Z cytokininů se často používají

(furfurylaminopurin)             Kinetin
Benzylaminopurin                  BAP
Thidiazuron
zeatin
izopentenyladenin

Mezi důležité vlastnosti cytokininů patří stimulace buněčného dělení (cytokineze), potlačení apikální dominance a  iniciace adventivních pupenů.
Giberelinů dnes známe více než 80 typů, označují se GA3, GA7 atd. Jejich důležitou funkcí je porušení dormance pupenů a semen, mobilizace zásobních látek v semenech při klíčení, indukce klíčení semen, indukce kvetení, prodlužování internodií spojené s podporou  růstu. Pro zpevnění média se nejčastěji používá agar. Pro výrobu agaru se používají stélky červených řas z čeledí Gracilariceae a Ceramiaceae. Vyskytují se v teplých oblastech Tichého a Indického oceánu. Obecně se používají koncentrace agaru 0,6-1,0%. Vedle nosné funkce má i další podstatnou a to, že chemikálie jsou v hmotě rozptýleny rovnoměrně a nesedimentují tak jako v tekutých médiích, Výhodou tekutých médií je lepší kontakt explantátu s mediem, ale je nutné s nimi nepřetržitě pohybovat. Z jiných gelujících látek je možné jmenovat Gerlite či Phytagel.
Každá buňka obsahuje celou sadu genetických informací, které jsou nezbytné k vytvoření celé rostliny. Exprese genů je přesně regulována tak, aby došlo k diferenciaci různých orgánů jak v čase tak prostoru. V in vitro kultuře musíme tento proces pozastavit a nahradit jiným programem. K rozeběhnutí somatické embryogeneze to bude program embryogenních genů. Somatickou embryogenezi můžeme rozdělit na přímou, kde jsou embryogení buňky již na explantátu a vyžadují k expresi pouze vhodné podmínky. A nepřímou somatickou embryogenezi, kde dojde k redeterminaci diferencovaných buněk a v části vzniklého kalusu se bude indukovat stav embryogeně determinovaný. Odvození kultur přes kalus a následná diferenciace adventivních pupenů je z hlediska bezpečnosti velice choulostivá, pro možnou nežádoucí tvorbu mutantů. Postup povede pomocí restituce a reprodukce, kde regenerují již existující základy.

Čtvrtou fází bude prodlužování prýtů a stabilizace rostlin. V této fázi je nutné eliminovat dopady koncentrací hormonů, zastavit odnožování a připravit silnou aktivní rostlinu na převod k tvorbě kořenového systému.

Pátou fází je tvorba kořenového systému a to buď dále v in vitro kultuře na příslušném médiu, zde může být v řadě případů vhodnější i tekuté, a nebo ex vitro. Často se používá pulzního ošetření báze stonku v roztoku auxinů a následné přímé umístění rostlin do substrátu.

Závěrečnou fází bude aklimatizace rostlin. Tomuto stupni mikropropagace je nutné věnovat velkou pozornost. Rostliny pěstované v uzavřených prostorách ve vysoké vzdušné vlhkosti, izolované, bez vlivu stresů, se kterými se setkají ve volné kultuře, jsou při převodu na vnější podmínky velice zranitelné.
Problém, se kterým se rostliny musí vyrovnat, je přechod ze situace, kdy, ač jsou schopné částečné fotosyntézy, potřebují k vývoji i organické látky, do stavu, kdy jsou plně autotrofní. Tedy kdy zdrojem uhlíku bude oxid uhličitý a světlo dodá energii. Cukry v médiu brzdí fotosyntetický aparát a při převodu rostliny do in vivo podmínek je nutné, aby si postupně vyrovnávala svou uhlíkovou bilanci. U některých rostlin dochází k tvorbě odlišné vnitřní struktury listu, k nedostatečně vyvinuté vrstvičce /kutinu/, která pokrývá vnější strany pokožkových buněk a zabraňuje ztrátám vody a bývají problémy i s funkčností listových průduchů.
Každý nový taxon v in vitro kultuře je nutné dlouhodobě testovat na reakce různých poměrů složek média tak, aby se docílilo kvalitního fyziologického stavu rostliny, bez jakýchkoli anomálií, a aby citlivě  reagovala na podněty v médiu požadovaným způsobem.
U řady Droser vyvoláme tvorbu adventivních pupenů na listových segmentech, u mucholapky její bohaté odnožování nových prýtů i tvorbu prýtů v celém povrchu listu včetně pastí. U rodu Nepenthes je možné podnítit prorůstání úžlabních axilárních  pupenů.
Těmito technikami se zabývají specializované laboratoře tkáňových kultur, které provádí vývoj živných médií a stanovují vhodné technologie mikropropagace. U ohrožených druhů masožravých rostlin a zejména rostlin, které se v přirozených podmínkách a v podmínkách umělých kultur rozmnožují velmi obtížně a jsou tímto obecně málo dostupné, jsou tyto metody jediným zdrojem jejich rozšíření mezi sběratele a obecně jejich zachování pro příští generace.

Dionaea muscipula

Dionaea 1


prorůstání nových rostlinek z celé plochy listu

dafdasfdsadDionaea 2


 z báze listu a středu pasti

Drosera regia

regiadasfadadsfaaddfasd


iniciace tvorby prýtů z povrchu listu  fáze množení  a fáze aklimatizace.

Drosera lanata


start kultury a fáze množení

Drosera pauciflora


 tvorba adventivních pupenů na listech, které jsou v kontaktu s médiem

Drosera  rotundifolia


fáze množení


Na závěr pohled do kultivační místnosti.

Podrobnější informace o technikách tkáňových kultur jsem shrnul do seriálu Krása TC a je publikován na stránkách časopisu Chramst na webu společnosti  Darwiniana.

http://www.darwiniana.cz/chramst/search.php?rstext=all-phpRS-all&rstema=21