Kultivace stonkových segmentů Meristémové kultury

Hegemonie vrcholu.

Vrcholek rostliny je jejím pánem. Svou nadvládou / apikální dominancí/ reguluje růst všech ostatních  částí. Poslem instrukcí jsou především  hormony, které řídí  vztahy mezi jednotlivými částmi rostliny a spolu s ostatními /enzymy,vitamíny a dalšími, o kterých ještě ani nevíme/ tvoří harmonický komplex, jehož části jsou mezi sebou navzájem obdivuhodně propojeny a tvoří  jeden funkční celek. Zásahem skalpelu do těchto vztahů se pouštíme na velice tenký led. /Je až obdivuhodné co u rostlin znamená touha žít./

Ve vegetačním vrcholku rostliny a v nejmladších  lístcích se ve větší míře tvoří hormon auxin. Ten putuje směrem dolů rostlinou do kořenů, které stimuluje k růstu a naopak brání v růstu úžlabním pupenům. Apikální dominance je oslabována hormonem cytokininem . Bohatší větvení rostliny je tedy možné docílit dvěma způsoby. Buď zvýšením hladiny cytokininů, nebo snížením hladiny auxinů.

S principy potlačení apikální dominance se setkáme  v následujících technikách mikropropagace. Jsou to metody, kterými se v zahradnické praxi množí téměř 99 % všech okrasných rostlin.

 

Kultivace stonkových segmentů. 

 Kultivace stonkových segmentů patří k velmi jednoduché a rozšířené metodě rozmnožování rostlin v podmínkách in vitro. Materiál získáme nejsnadněji naklíčením semen v sterilní kultuře, nebo částí odebranou z matečné rostliny, obsahující několik listových  segmentů, kterou vysterilizujeme. Tato se rozdělí tak, aby  výsledný obsahoval jeden úžlabní axilární pupen. Nově vzniklé prýty se stejným způsobem rozřezávají a dále kultivují. Listy je možné v bazální části odříznout. Tato metoda je sice pomalejší, ale je z hlediska možnosti vzniku mutací velmi bezpečná.

 

 
Rozdělení stonku na části s jedním úžlabním který prorůstá v nový prýt

 

Je-li rostlině geneticky dáno, že nebude tvořit třeba adventivní pupeny, tak žádným hormonem ji k tomu nedonutíme.To je jeden moment, druhý je ten, tam kde to možné je, jej i v neindukčních podmínkách vynutit. Jednoduše řečeno hormon v určité koncentraci si musí najít cílovou buňku, nebo skupinu buněk, která na jeho přání bude reagovat./než k této reakci dojde proběhne na buněčné úrovni ještě celá řada dalších procesů z nichž jsou některé již objasněny/. Jakýkoli růstový proces je vždy ovlivňován spoluúčastí více hormonů v různé koncentraci a neexistuje hormon, který by řídil pouze jeden proces. V rámci celistvé rostliny se jedná o jakousi internetovou síť, na které vládne souhrnný hormonální systém.

 

Meristémové kultury. Kultivace vzrostných vrcholů.

Velký význam při ozdravování rostlin od viróz, bakteriálních a houbových nákaz hrají kultury odvozené z čistého meristematického vrcholu, tedy bez listových základů.Velikost  0,2-1 mm. Tato oblast růstových buněk nemá vazbu na cévní svazky, které představují hlavní cesty šíření patogenů. Kultura se odvozuje z apikálních nebo axilárních meristémů a umožňuje i namnožení rostlinných druhů, které lze přirozeně rozmnožovat jen velmi obtížně. Před odebráním meristému je možné  ošetřit matečnou rostlinu termoterapií, tady působením vyšších teplot až do 40°C, které mohou napomoci eliminovat virózy.

Kultivace vzrostných vrcholů spočívá v izolaci vrcholové části rostliny ve velikosti do 3 mm. Nejedná se o izolaci meristému , explantátu stále zůstává několik listových základů. Pomocí hormonů přítomných v médiu /cytokininy/ se ruší vliv apikální dominance a dojde k prorůstání postraních výhonků. Ty se dále dělí a stejný postup se dále opakuje do  požadovaného množství. Při vyšších koncentracích hormonů může dojít k tvorbě adventivních prýtů, kde by hrozila možnost mutací a je to signál k revizi média.

Rozmnožování láčkovek pomocí technik in vitro je poměrně bezproblémová záležitost. Jsou však drobná úskalí, která se s různým stupněm úspěšnosti dají překonávat. Je to však věc dlouhodobá a je nutné se obrnit trochou trpělivosti. S povrchovou kontaminací se vypořádáme běžnými postupy poměrně snadno, ale vnitřní kontaminace je o to více zákeřná tím, že se sní můžeme setkat i po měsících kultivace, kdy jsme už žili v přesvědčení, že jsme zvítězili. Předcházet tomuto překvapení musíme ještě v době než rostlinu umístíme na agar. První lázeň po odejmutí vrcholového řízku, nebo úžlabního pupenu bude v roztoku širokospektrých antibiotik. Můžeme použít jak  baktericidní -  peniciliny tak i bakteriostatická - tetracykliny.  Tetracyclin má široké antimikrobiální spektrum, působící na většinu bakterií včetně některých anaerobů a také na část prvoků. Toto antibiotikum nemůžeme použít do média pro jeho termolabilitu. Velmi často užívaný je také Chloramfenikol, Gentamycin, Neomycin, Streptomycin.

Metod jak získat produktivní kulturu je několik. První možností bude převést růstový vrcholek. Nechat odrůst pár listových segmentů, odříznout vrcholek a donutit tak rostlinku k prorůstání úžlabních pupenů. Tyto postupně izolovat a pokračovat stejným způsobem dál. Druhou možností izolace úžlabního pupenu s následným totožným postupem. Jemným ovlivněním rostlinnými hormony donutíme rostlinky vytvářet v bázi stonku postraní pupeny a jen se těšíme pohledem jak rostlinky plní kultivační nádobu /lesíkují –nový výraz prosím, čeština je tvárná/. Toto se děje bez tvorby kalusu. Další pak získat kulturu z listového segmentu. Toto se mi většinou zadaří pomocí tvorby kalusu a následné regenerace v rostlinku.

 

   

Nepenthes ventricosa -  izolace úžlabních pupenů a jejich následná kultivace.
Odstup fotografií je dva měsíce.

   

izolace úžlabních pupenů

   

Nepenthes medusa prorůstání úžlabního pupenu. Časový odstup tři týdny.

 

N. tobaica po odstranění vrcholu růst úžlabních pupenů

 

 

Nepenthes macfarlanei  N. madagascariensis – prorůstání rostlinek pomocí bočních pupenů.

 

Pokud se nám nedaří léčení vnitřních svazků a kontaminace se dále projevují, je nutné sáhnout skalpelem do rostlinky hlouběji. Postupným odstraňováním listů se dostaneme až k růstovému vrcholku. Pod pár listovými základy se nachází shluk buněk, kterému se říká meristém. Je to útvar, který není napojen na cévní svazky a tudíž se k němu nemůže dostat žádná havěť a infikovat ho. Tímto způsobem se dostaneme k bezviróznímu materiálu, který je pro další kultivaci to nejlepší co si můžeme přát. Čistý meristém je velikosti 0,2-0,5 mm hladkého povrchu. Při práci je nutné postupovat rychle, aby nám v průvanu laminárního boxu příliš nezaschl. V tomto případě máme jen jeden pokus. Doporučené zvětšení binokulárního mikroskopu pro tuto práci je 40x a nejlépe nedýchat. Prorůstání rostlinky pozorujeme zhruba do 2-3 týdnů.

 

   

Umístění meristémů ve zkumavkách

 

Meristém jsou základní nediferencované buňky tvořící pletivo, které je specializované na tvorbu nových buněk. Většinou jsou malé, tenkostěnné bez mezibuněčných prostor. Najdeme je na vrcholku rostliny, tam kde se tvoří buňky primárních pletiv a dále v základech nových listů a také mezi čepičkou a tělem kořene. Tomuto říkáme apikální meristém. Dále můžeme na rostlině najít meristém laterální, který je uložen třeba souběžně s tělem stonku, interkalární v bázi stonkových článků a listů. Meristémy můžeme také dělit na Promeristém to je skupinka nejmladších buněk v apikálním meristému. Primární meristém  jsou apikální meristémy, které produkují primární pletiva. Sekundární meristém vzniká dělením pletiv, která již prošla částečně diferenciací. Latentní meristém jsou zbytky apikálního meristému oddělené trvalými pletivy. Jejich aktivace je podmíněna změnou podmínek. Pro naši práci je důležitý apikální meristém růstového vrcholku a spící meristémy úžlabních pupenů.

Samozřejmě, že je v prvé řadě důležitý výběr zdravě rostoucí rostliny, která nevykazuje známky deformací, skvrn na listech či jiných nezdravých příznaků. Problémem jsou omezené zdroje, cena a dostupnost vzácnějších rostlin a připomeňme, že máme jen jeden pokus.

Mnohdy se řada neúspěchů svádí na vnitřní kontaminaci, ale tato se projevuje charakteristickým rysem. Vždy je snazší obvinit cévní svazky, než sebe z nedbalosti nebo nedostatku sterility při práci.

Posledním úkolem po namnožení rostlinek je tvorba kořenového systému. Toto je možné jak ve sterilních podmínkách, tak ex vitro v průběhu aklimatizace.

 

N. madagascariensis tvorba kořenového systému

 

Průběh aklimatizace 

 

 

Odměnou za ty nervy a piplavou práci jsou zdravé  a svěže rostoucí rostlinky

 

Toto krátké seznámení s možnostmi množení láčkovek a ozdravení kultur rostlin obecně, jistě alespoň v náznaku seznámí zájemce a pěstitele s možnostmi, které současná technika a znalosti umožní v rámci praktického využití v kouzelné oblasti našich masožravých rostlin.