Vzhledem k tomu, že explantátové kultury /kultury in vitro, tkáňové kultury, tissue culture, proto tedy TC/ znamenají kultivaci částí rostlin v aseptickém prostředí, bude nejlépe začít tímto problémem. V celém procesu kultivace je nezbytné se zabývat sterilitou použitého rostlinného materiálu, sterilitou prostředí, ve kterém s explantáty pracujeme a sterilitou živných médií. Kultivace v aseptickém prostředí má své nevýhody /drahé přístroje, chemikálie, pracnost a nepohodlí v boxu/, ale je nezbytná vzhledem k tomu, že v médiu je obsažen především cukr a vitamíny. A v takovémto prostředí rostou bakterie a houby řádově  rychleji než samotné explantáty a během velmi krátké doby jsou schopny zničit celou kulturu.

K desinfekci rostlinného materiálu se používají nejběžněji etanol 70 % -1-2 min., po té  koncentrace SAVA , CLOROXU 5-10% s přidáním kapky smáčedla /Jar/ + oplach 3x v sterilizované destilované vodě. Dobu nutnou k desinfekci /10-20 min/ nelze obecně stanovit, záleží na druhu rostliny nebo její části, a je zde nutné najít uzoučkou hranici mezi tím kdo přežije - jestli explantát nebo kontaminující látky. Tato hranice se hledá u řady rostlin velice obtížně.

Jako další roztoky, používané při sterilizaci, je možné uvést : peroxid vodíku 3-12%, chlornan sodný 0,5-5%, chlornan vápenatý 9-10%, chlorid rtuťnatý 1%, pro lepší smáčivost se přidává opět kapka Jaru.

Sterilizace semen se dá provádět řadou způsobů. Pomocí papírových psaníček, do kterých zabalíme porci semen a takto desinfikujeme, nebo za pomoci injekční stříkačky, do které k semínkům natáhneme desinfekční roztok, třepeme a po potřebné době je necháme klesnout ke dnu, roztok vytlačíme a následně takto postupujeme s proplachováním vysterilizovanou destilovanou vodou a to nejméně pětkrát. Použijeme-li k desinfekci bělicí prostředek tak nám malá semínka zmizí naprosto z dohledu.  Z tohoto  důvodu  jsem založil masožravou zahrádku a veškerou použitou oplachovou vodu   jsem tam nalil.  Během několika týdnů se začala intenzivně zelenat.

Po této zkušenosti k desinfekci drobných semínek používám již jiné prostředky. Injekční stříkačky i jehly lze ve sterilním balení levně, nebo zadarmo, pořídit v lékárnách, v oblastech s větším výskytem fetujících spoluobčanů.

Sterilitu prostředí, ve kterém pracujeme, se snažíme dodržet splněním těchto základních požadavků. Při troše šikovnosti si můžeme vyrobit laminární box.V boxu je proti vám hnán ventilátorem vzduch ošetřený Hepa filtrem, který zabrání vstupu mikročástic (a tedy i spor bakterií a hub) do pracovního prostoru. Rychlost proudění se pohybuje okolo 0,5m/s. Je možné použít i na bok položené akvárium, ale zde je možnost kontaminací mnohem větší. Velkou pozornost musíme věnovat čistotě nástrojů. Před započetím práce je sterilizujeme zabalené třeba v alobalu a potom pomocí lihového kahanu je ožíháme před každou operací. Ruce ošetříme například Sterilliem. Na ústa užít roušku /ústenku/. Místnost i prostor boxu můžeme částečně sterilizovat 20 min. UV lampou – horským sluncem. Čistým nedenaturovaným lihem v ručním rozprašovači nešetříme.

 

Sterilizace médií. V tlakovém hrnci nedosáhneme tlaku 1 Atm, tím tedy ani 121°C. Teplota tak kolem 105°C, dostačující k likvidaci řady kontaminujících látek, při použití autoklávu nastaveného na 1Atm - 121°C je sterilizace médií na většinu patogenů  podstatně dokonalejší. Používání mikrovlnky je sporné, spíše vhodné tak pro jednu petriho misku nebo sklenici, tedy jen na ověření malých vzorků, nebo ošetření skla před plněním médiem. Obecně lze vypozorovat, že čím větší množství média se vaří a čím větší nádoba, tím vše lépe roste. /V případě dávkování 0,01mg/l chemikálie v zásobním roztoku uděláte menší chybu u 2 litrů než u 2 deci/.

 

Média.

 

Základní M&S médium bylo vyvinuto pro kulturu tabáku a protože pánové MURASHIGE & SKOOG odvedli prvotřídní práci tak „hrnečku vař“, ale pro naše masožravé  potřeby je toto medium příliš silné až smrtící. Při sestavení média pro danou rostlinu je nutné ji nejdříve ze všech pohledů nastudovat - morfologie, anatomie, fyziologie atd., zvolit nejvhodnější způsob mikropropagace /meristémy, úžlabní pupeny, různé části semenáčků, atd./ a po té laboratorně ověřovat její reakce, jak na koncentrace a poměr mikro a makro elementů, tak na různé druhy hormonů, hodnot pH media, které hraje také důležitou roli a zde si s lakmusovým papírkem nevystačíme.  Je to dlouhodobá práce a žádná komerční laboratoř se s výsledky své práce nebude samozřejmě svěřovat světu na internetu, jak na to. U řady zaručených receptů, které jsem na netu při shánění informací shromáždil, jsem si ověřil, že jsou v řadě případů nevhodné. Věřím tomu, že po správném vyladění medií porostou i Heliamphory jako mucholapky, ale to chce čas a trpělivost a v tom je krása TC.

Cena médií již není tak dramatická a je možné je získat za příznivější ceny. Zde bych doporučil fy. BIOTECH, /jsou velice vstřícní a kreativní a dodací lhůty velmi uspokojivé/ na jejich www stránkách najdete produkty DUCHEFA – ceník obsahuje /30 stran/, kompletní potřeby pro TC od desítek druhů médíí, hormonů, plastů až po skalpely . Cena základního MS media pro 50l stojí vč. DPH 1000.- takže na 1l 20 Kč a to je již docela slušné. Máte možnost si vybrat z cytokininů  třeba kinetin 1g za 800.- nebo zeatin 1g za 60 000.- to už záleží na okolnostech, nebo na manželce /mne by tedy okamžitě poslala do blázince/.

Kupovat hotovou MS směs vč. vitamínů, cukru a agaru bych nedoporučoval, je to drahé a pokud nechci množit tabák, tak těžko použitelné. V případě ředění je problém s doplněním položek , které ředit nechceme –mikro ,makro elementy, cukr, agar, vitamíny.

Při vaření médií musíme dávat pozor na reakci agaru, po dosažení určité teploty začne tekutina kypět a máme problém. Proto je nezbytné volit velikost nádoby alespoň s 50% rezervou a průběh pečlivě sledujeme, mícháme a regulujeme podle potřeby plamen sporáku. Jako nádoby pro kultury je možné použít sklenice od dětské výživy, zkumavky, plasty musí být s označením PP. Zde po pečlivém umytí můžeme navíc použít mikrovlnou troubu.

 

Porovnání hodnot koncentrací mikro a makro elementů vybraných médií

 

 

 

Sestavení média.

 

Každé médium zpravidla obsahuje tyto části:

 

Mikro elementy– v různých  koncentracích

Makro elementy– v různých  koncentracích

Vitamíny – v různých kombinacích a koncentracích

Hormony - v různých kombinacích a koncentracích

Cukr  20 –30 g/l

Agar  6-10 g/l

Nastavení pH podle požadavku – obvykle 5,5-5,8

 

Vitamíny a hormony si připravujeme v zásobních roztocích. Hormony jsou ve vodě nerozpustné. Je nutné rozpustit v etanolu nebo 1N NaOH, podle pokynů výrobce. Ze zásobních roztoků potom pipetujeme potřebná množství.

Z výše uvedeného porovnání ověřených médií vidíme, jak rozdílné mohou být požadavky na složení základních prvků pro jednotlivé rostliny.

Všechny složky média, jak je možné pozorovat, jsou silně pohyblivé a nelze s určitostí předem stanovit co která rostlina potřebuje. Na toto platí akademická citace „nutno laboratorně ověřit“, nebo mě osobně milejší „v tom je krása TC“.

 

Hormony

 

Rostlinné hormony jsou organické sloučeniny vyrobeny v jedné části rostliny, a převedeny do jiné části, kde způsobují odezvu.

Rozeznáváme pět základních skupin:

 

auxiny

cytokininy

gibereliny

kyselina abscisová

etylén

 

Auxiny

 

V roce 1936  Köhler identifikoval auxin v lidské moči a později Thimannen i v rostlinách.

Byla to  kyselina indolyl-3-octová - IAA. Přírodní velice nestabilní auxin. Zde šetřit nebudeme a koupíme jej radši v prášku.

 

Přírodní

kyselina indolyl-3-octová                   IAA

kyselina indolyl-3-máselná                  IBA

Syntetické

a-naftyloctová                                  NAA

1.      

2,4-dichlorfenoxyoctová                             2,4-D,

deriváty kyseliny pikolinové               picloram

benzoové kyseliny                             dicamba

kyselina indolyl-3-propionová            2.     IPA

 

Vliv auxinů

podporuje prodlužování buněk, způsobuje apikální dominanci, stimuluje vývoj cévních svazků, růst kořene, zakládání adventivních kořenů

 

Cytokininy

 

Syntetické pro naše potřeby dostačující

 (furfurylaminopurin)       Kinetin

Benzylaminopurin BAP

Thidiazuron

 

Z přírodních je možné jmenovat

zeatin

izopentenyladenin

 

Vliv cytokininů

mezi důležité patří stimulace buněčného dělení (cytokineze), potlačení apikální dominance,  iniciace adventivních pupenů,

 

 

Gibereliny

 

Dnes známe více než 80 giberelinů     označují se GA3, GA7 atd.

Mezi důležité funkce giberelinů můžeme zařadit

porušení dormance pupenů nebo semen, mobilizace zásobních látek v semenech při klíčení, indukce klíčení semen, indukce kvetení , prodlužování internodií spojené se stimulací růstu 

 

Kyselina abscisová

 

Kyselina abscisová je hlavním faktorem při přizpůsobení rostlin na stres.

Mezi důležité vlivy kyseliny abscisové můžeme zařadit iniciaci dormance pupenů a semen, kontrolu zavírání průduchů při vodním stresu, tlumení působení ostatních růst podporujících fytohormonů.

 

Etylén

 

Když manželka očesala na podzim jablka a v lískách je odložila v zimní zahradě s pokynem „ukliď je do sklepa“, k jejímu úžasu jsem poslechl okamžitě. Vzhledem k tomu, že jsem si vzpomněl na účinky tohoto plynného fytohormonu, který podporuje tvorbu odlučovací vrstvy listů při jejich opadu. Etylén produkují všechny části rostliny, ale v největším množství právě dozrávající ovoce. Neodvážil jsem se ověřovat jak budou na různé koncentrace etylénu reagovat láčkovky.

Vlivy etylénu mohou být velmi rozmanité:

trojná odezva - kořeny nerostou geotropicky, tloustnutí stonků, řapíky listů  se zakřivují směrem ke stonku.

Potlačení dlouživého růstu stonků a kořenů, zvýšení tloustnutí stonku a kořenů, zvyšuje horizontální růst, vyvolává tvorbu adventivních kořenů a již zmíněné odlučovací vrstvy v řapících listů a plodů.

Etylén je produkován všemi rostlinnými částmi. V nejvyšší míře ho tvoří  dozrávající plody, stárnoucí pletiva a meristém. Také je produkován jako reakce na stres při poranění rostliny nebo invazi patogenů.

 
         Většinu používaných a dostupných hormonů můžeme autoklávovat 2,4-D,IAA,IBA, 6-BAP,kinetin,2-iP, výjimku tvoří třeba gibereliny, které je nutné sterilizovat filtrací /nebo zeatin riboside - ten také/. Zde je možné při  ztrátě účinnosti, která se může pohybovat okolo 50 %, i tyto autoklávovat. Zde bych ale doporučil předem „laboratorně ověřit“/.

Koncentrace hormonů je udávána dvěma způsoby. V mg/l media nebo v μM. Z μM je nutné jednoduchým výpočtem si převést na lidskou hodnotu mg/l. Třeba kinetin /6-Furfurylaminopurine/ C10H9N5O součet  215,21

 

kinetin =    215,21 x 2,3 μM:1000  = 0,494983 mg/l tedy 0,5 mg/l

a opačně Thiamine HCL /vitamín/ = 0,1 mg/l : 337,3 x 1000 = 0,29 μM

Pro orientaci uvedu molekulární váhy  pro nejběžnější hormony

2,4-D = 221,04,    IAA= 175,18,    IBA= 203,23,     6-BAP= 225,25,     kinetin= 215,21,      2-iP= 203,2

 

 

Vitamíny

 

Nepostradatelný pro in vitro kultury je thiamin, užívá se v koncentracích od 0,1 mg/l. M&S medium 0,1 mg/l, Nitsch medium 0,5 mg/l, Schenk&Hildebrandt  5mg/l, Gamborg B5  10 mg/l, ostatní používané vitamíny myo-inositol, k.nikotinová, piridoxin atd. jsou podpůrné pro stimulaci růstu, ale je možné se bez nich v řadě případů i obejít. Inositol je zahrnován do skupiny B-vitamínů /B8/Je zajímavé, že lidské tělo si ho vyrábí v malých množstvích samo pomocí střevních bakterií. /Zde bych také doporučil raději navštívit lékárnu./

 

 

 

Agar

 

Pro výrobu agaru se používají stélky červených řas z čeledí Gracilariceae a Ceramiaceae. Vyskytují se v teplých oblastech Tichého a Indického oceánu. Agar z těchto ruduch je směs polysacharidů, především agarozy – až 70%. Čistota agaru je pro laboratorní účely důležitá. Agar obsahuje hořčík, sodík, draslík, vápník – může obsahovat sacharidy, aminokiseliny i vitamíny ve stopovém množství, takže  u citlivějších rostlin na některé z těchto prvků je někdy nutné užití agaru zvážit a použít třeba jiné gelující látky /Gerlite, Phytagel/. Obecně se používají koncentrace agaru 0,6-1,0%. Vedle nosné funkce má i další podstatnou a to, že chemikálie jsou v hmotě rozptýleny rovnoměrně a nesedimentují tak jako v tekutých médiích, kde je nutné s nimi nepřetržitě pohybovat. Výhodou je lepší kontakt explantátu s mediem. Při následném přesazení na agarové pak lépe roste. Když je prostor, tak si takovéto kolo na zkumavky můžeme celkem jednoduše vyrobit /jako podklad může posloužit plastová koupelnová rohož kam přesně pasuje  zkumavka 16 mm/ . V tomto případě ušetříme za agar, ale zase živíme motorek.

U agaru dochází ke ztuhnutí  okolo 40-50 °C. Výhodou syntetických může být jejich čistota a dokonale hladký povrch, na kterém se snáze identifikují případné kontaminace.

 

Kontaminace.

 

První kontaminace tj. znečištění kultury cizorodým organismem, např. houbou se projeví v průběhu 3-4 dnů. Podle zkušenosti není možné, byť malý projev na povrchu, s úspěchem odstranit. Jak daleko je prorostlé do média nejsme schopni posoudit. Ale v některých případech, když včas zaznamenáme problém, může být úspěšné vzdálenější segmenty od epicentra přepíchnout do jiné nádoby. Pro tento případ si můžeme při každém pasážování nechat rezervu  třeba dvou neobsazených nádob.

Při dodržení sterilního prostředí při manipulaci s rostlinným materiálem nástroji atd. při dokonalé povrchové desinfekci, může dojít ke kontaminaci organismy, které přežívají v pletivech rostliny /třeba kvasinky/. Tyto příhody vás překvapí třeba i po 3 měsících kultivace, kdy jste se již smířili s vítězstvím.

 

 Fotoperioda

 

Standartně se používá 16/8 a pro naše účely se mi osvědčila. Osvětlení bílá zářivka /tedy ne drahé speciály Flora, GLO a pod./ Na fotosyntézu si počkáme až později. Cukry si explantát bere z média.

Doporučené hodnoty fotonové ozářenosti jsou kolem 20 mmol·m^–2·s^–1 (přibližně 1 500 až 2 000 lx).

 

 

Metodika

 

Při úvahách,  jak se dostat kytičce na kobylku, je možné si rozpracovat určitou metodiku /pavouka/a do ní postupně doplňovat informace.

 

Subjekt zájmu

 

Stavba rostliny

Volba druhu mikropropagace

Získání max. možných informací o anatomii rostliny

Získání max. možných informací o fyziologii rostliny

Získání max. možných informací o přirozených podmínkách

/graf klimatických podmínek je možné pro některé oblasti získat na webu/

Formulace zkušeností s rostlinou ve své sbírce

 

 

Přípravné ověřování

Rekce na koncentrace mikro a makro elementů

různé poměry NPK

ověřování reakcí na druhy auxinů

ověřování reakcí na druhy cytokininů

ověřování reakcí na různé kombinace auxinů a cytokininů

ověřování reakcí na různé hodnoty pH

Stanovení teploty při kultivaci

Stanovení intenzity osvětlení a fotoperiody

A zde můžeme doplňovat další a další nohy pavouka.

 

Vyhodnotíme a můžeme začít, je to prosté.

 

Po úspěšném startu kultury budeme s ověřováním obdobně pokračovat pro doladění médií dalších stupňů. Při troše štěstí se dobereme třeba již do jednoho roku k celkem uspokojivému výsledku. Je to přece pohodové si takhle hrát, když je čas a dostatek zkumavek. I v tom je krása TC.

S postupem času věnovanému pěstování rostlin ve skle si  mnohem intenzivněji uvědomuji, že k rostlinám v agaru získávám zcela jiný vztah, než ve volné kultuře. Bude to patrně tou panenskou čistotou prostředí a rychlým zdravým růstem, bez dopadu vnějších negativních vlivů prostředí, které rostlinu stresují. Ať to jsou výkyvy počasí, nebo škůdci. / neustálý boj se smutnicemi, mšicemi a podobnou havětí/.

Z výše uvedených poznámek vyplývá, že celá problematika TC v rámci „zájmové činnosti“ vás časem donutí k rozhodnutí, zda toho včas nechat /vymýt plísně ze sklenic a uložit je na polici mezi marmelády/, nebo to vzít vážněji, vystěhovat nádobí z obýváku a obsadit doma třeba tělocvičnu, když je to možné. Začít studovat a šetřit na vybavení laboratoře.